近日，南昌大学食品学院食品营养与健康创新团队的胡淇睿、陈芳副教授、邓泽元教授等人在国际期刊Phytomedicine发表了题为“Ginsenoside Rh2 and its octyl ester derivative inhibited invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma via the c-Jun/COX2/PGE2 pathway”的文章。本研究旨在探讨Rh2及其辛酸酯衍生物Rh2-o对肝细胞癌侵袭转移的抑制作用，以及这些作用是否依赖于c-Jun/COX2/PGE2通路。本文通过划痕实验、trans-well实验和荷瘤小鼠实验验证Rh2和Rh2-o对肿瘤侵袭转移的抑制作用，并通过添加外源性PGE2、COX2和c-Jun的过表达验证c-Jun/COX2/PGE2通路的参与。最终结果表明Rh2和Rh2-o可通过抑制c-Jun/COX2/PGE2通路介导的EMT来抑制肝癌的侵袭转移。第一作者为2021级博士研究生胡淇睿，通讯作者为陈芳副教授。
肝癌发病率高、死亡率高，是一个严重的全球性健康问题。目前，世界范围内肝癌的5年生存率低至10-20%。肝癌治疗的主要挑战是高复发率和高侵袭能力。肺转移和淋巴结转移是肝癌的常见并发症，会严重影响患者的日常生活。因此，探索肝癌侵袭转移机制，制定相应的治疗策略成为当前的研究方向。
上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是诱导癌细胞转移的主要过程之一。EMT的特点是粘附连接和顶部极性的减少，最终促进细胞的运动和侵袭。对于肿瘤组织，EMT允许肿瘤细胞脱离原发肿瘤部位，侵入周围组织或远端器官。转录因子Snail作为EMT的主要调节剂可下调上皮细胞-细胞连接蛋白和上调间充质生物标志物(包括vimentin、N-cadherin和基质金属蛋白酶(MMPs))。因此，抑制Snail、vimentin、N-cadherin和MMPs的表达可能是抑制EMT的有效途径。
前列腺素E2(PGE2)是最常见的前列腺素，参与增殖、免疫调节和代谢等多种生物过程。在肿瘤组织中，PGE2可以促进细胞增殖、血管生成和转移，成为肿瘤发展的关键介质。PGE合成酶主要与环氧合酶(COX)相关，COX2负责生成PGE2。COX2在正常组织中一般表达不显著，但在包括肝细胞癌在内的各种肿瘤组织中均有高表达。越来越多的证据表明，COX2参与了癌症的发展和侵袭。此外，已经发现几种药物通过COX/PGE2途径抑制癌细胞的EMT。然而，COX/PGE2途径诱导的靶向EMT的合成药物往往具有严重的副作用并诱发耐药。因此，迫切需要发现能够靶向COX2/PGE2通路，抑制肿瘤侵袭转移的副作用较小的天然药物。
人参皂苷Rh2是人参中具有较强抗癌活性的主要成分。Rh2作为一种植物化学物质，具有副作用小、药食同源等优点，在癌症治疗中具有优势。当然，大量文献已经证明Rh2可以通过抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的表达和调控EMT的生物标志物来抑制肿瘤的侵袭和转移。HDAC4的募集、miR-31的过表达、IL-6/STAT3和PI3K/Akt通路的抑制都被证明是Rh2诱导的MMPs减少的原因。然而，Rh2调控EMT生物标志物的机制尚不清楚。同时，有报道称人参皂苷Rg3通过促进c-Jun的乙酰化和降解来抑制皮肤鳞状细胞癌的EMT。但是，c-Jun的下游还没有相关研究。c-Jun是JNK通路中的一个转录因子，通过调节代谢和炎症反应参与癌症的发生和进展。大量证据表明c-Jun与COX2的表达呈正相关。此外，人参皂苷也被证明通过COX2发挥抗炎作用。因此，Rh2是否能够通过c-Jun/COX2/PGE2途径抑制肝癌的EMT，值得探讨。
此外，我们在之前的研究中合成了人参皂苷Rh2的单辛酸酯衍生物(Rh2-o)，以提高Rh2的生物利用度。我们的研究结果表明，Rh2-o在肝癌中具有比Rh2更强的促凋亡、抗增殖和免疫调节作用。因此，我们有理由推测，Rh2-o可能比Rh2具有更强的抑制侵袭转移的作用。
综上所述，本研究旨在探讨Rh2和Rh2-o对肝癌侵袭转移的抑制作用，以及这种抑制作用是否依赖于c-Jun/COX2/PGE2通路。
Results
1.Rh2和Rh2-o抑制肿瘤的转移和侵袭
Rh2和Rh2-o可抑制Huh7人肝癌细胞的细胞活性、迁移活性，并在体内外均能抑制EMT相关蛋白的表达。
2.Rh2和Rh2-o抑制COX2/PGE2通路
Rh2和Rh2-o可抑制PGE2的分泌，并在体内外抑制COX2的蛋白表达。
3.Rh2和Rh2-o通过COX2/PGE2途径抑制转移和侵袭
外源添加PGE2及COX2过表达可显著逆转Rh2和Rh2-o引起的肝癌细胞迁移抑制及EMT相关蛋白表达抑制。
4.c-Jun的过表达逆转了Rh2和Rh2-o对肿瘤转移和侵袭的抑制作用
过表达c-Jun可显著逆转Rh2和Rh2-o抑制的EMT相关蛋白的表达。
Disscussion
作为人参的主要成分，人参皂苷Rh2已被证明具有抗癌活性。此外，大量文献也报道了人参皂苷Rh2对肿瘤侵袭转移具有抑制作用。在我们之前的研究中，Rh2-o甚至表现出比Rh2更强的抗癌和免疫调节活性。因此，Rh2-o是否比Rh2具有更强的抑制肿瘤侵袭转移的活性值得评价。当然，其潜在的机制也应该被研究。
在目前的研究中，c-Jun/COX2/PGE2通路被证明参与了Rh2和Rh2-o对肝癌侵袭转移的抑制作用(图6)。COX2/PGE2通路也被证明在癌细胞的侵袭转移中发挥了至关重要的作用。肿瘤微环境中的PGE2能够识别PGE2受体并与之相互作用。EP1、EP2、EP3和EP4(PGE2受体)在肿瘤细胞细胞膜上的表达，反过来激活肿瘤细胞中的PI3k通路和JAK/STAT3通路，最终促进侵袭和转移。幸运的是，Rh2已被证明不仅可以阻断COX2/PGE2通路，还可以抑制PI3k和JAK/STAT3通路的激活。
此外，根据我们的研究结果，Rh2和Rh2-o可以通过c-Jun调节COX2/PGE2通路。c-Jun的乙酰化可能是Rh2和Rh2-o对侵袭转移发挥抑制作用的关键因素。一般地，提高乙酰化水平的途径主要有两种:促进乙酰化或抑制去乙酰化。Sirtuin 1和Sirtuin 2都是常见的去乙酰化酶，大量研究报道Sirtuin 1和Sirtuin 2可以在各种类型的细胞(如T细胞、成骨细胞、鼻咽癌细胞和Hela细胞)和小鼠模型中使c-Jun去乙酰化。研究表明，包括CK(Rh2的代谢物)在内的多种人参皂苷可以抑制Sirtuin 1的表达。因此，Sirtuin 1的调控可能是Rh2和Rh2-o在肝细胞癌中促进c-Jun乙酰化的可行途径。
有趣的是，在小鼠模型中，Rh2-o对EMT的作用明显强于Rh2，但在体外没有观察到这种显著差异。这些结果表明，EMT的抑制是一个涉及多种细胞或系统的复杂过程。免疫细胞和癌症相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中的主要成分，它们都被证明与癌细胞的EMT相关。一方面，众所周知，EMT与免疫抑制细胞和各种炎症细胞因子(如IL-6,IL-8,TNF-α和TGF-β)。具体来说，在EMT相关的免疫抑制过程中，能够分化为毒性T细胞的CD8+T细胞被耗尽，而能够分化为Treg细胞的CD4+T细胞促进了EMT的过程。在之前的研究中，Rh2被证明可以降低荷瘤小鼠CD4+/CD8+细胞的比例，并且Rh2-o的作用强于Rh2。因此，调节肿瘤免疫微环境的平衡可能是Rh2-o对EMT的作用优于Rh2的原因。另一方面，CAFs可以分泌TGF-β，可能是EMT的另一种诱导剂。实际上，CAFs中的hedgehog信号和Wnt信号以及cas分泌的肝素结合细胞因子也可以部分介导癌细胞的EMT。最新研究表明，人参皂苷可以抑制皮肤真皮成纤维细胞和肝脏成纤维细胞的激活。因此，Rh2和Rh2-o具有抑制CAFs活化的潜力。此外，自噬已被证明是EMT在迁移和传播过程中所必需的。大量文献表明，Rh2可以抑制癌细胞的自噬。
综上所述，肿瘤免疫微环境、CAFs和自噬的调节也可能是在体内Rh2和Rh2-o抑制EMT的机理。此外，Rh2-o较强的免疫调节作用可能导致其在体内对EMT的抑制作用优于Rh2。因此，或可进一步研究Rh2或Rh2-o对免疫系统与EMT之间串扰的影响。
Conclusion
综上所述，人参皂苷Rh2及其辛酯衍生物Rh2-o均能抑制Huh-7细胞的转移和侵袭，并在体外和体内抑制EMT。此外，c-Jun/COX2/PGE2通路被证实与Rh2和Rh2-o对肝细胞癌转移和侵袭的抑制作用有关。本研究揭示了Rh2和Rh2-o对转移和侵袭具有显著抑制作用的可能机制。
2024年1月8日
来源：南昌大学
