导 读
2025年3月，北京工商大学孙宝国院士团队李秀婷教授课题组在国际Top期刊《Journal of Agricultural and Food Chemistry》（Q1，IF=5.7）发表题为“Characterization and Mechanism Study of a Novel Ethanol Acetyltransferase from Hanseniaspora uvarum (EatH) with Good Thermostability, pH Stability, and Broad Alcohol Substrate Specificity”的研究性论文。2023级博士研究生倪冰倩为论文第一作者，李秀婷教授为论文通讯作者。该研究得到国家自然科学基金项目（32372280和31830069）和北京市教委-市自然基金联合项目（KZ202110011016）的资助。
乙酸酯是发酵、烘焙食品中花果香风味的主要贡献者，更因其良好溶解性、较低毒性及可降解性，成为食品加工、医药与化工领域的重要原材料之一，且全球年需求量持续增长。然而，目前依赖高能耗、高污染的化学合成来生产乙酸酯的传统方法，在现今全球碳达峰碳中和“双碳”战略倡导下，亟待低能耗、低污染、高效率的生物合成技术路径来替代。研究表明，尽管乙酸酯的生物合成可由脂肪酶/酯酶等催化醇、酸等底物来实现，但绝大多数脂肪酶/酯酶在催化乙酸酯合成过程中，需控制反应体系保持较低的水含量以防止酯化反应由合成转向水解，而添加有机溶剂等助剂则加剧了环境压力。课题组前期从产酯酵母——异常威克汉姆酵母YF1503中发掘到醇酰基转移酶Eat276，其能在水相条件下高效催化乙醇与乙酰辅酶A合成乙酸酯，因此，利用Eat在水相条件下催化乙酸酯的生物合成，是取代目前化学合成法生产乙酸酯的最可行路径之一。然而，值得注意的是，目前对于微生物来源醇酰基转移酶Eat的相关研究较为匮乏，Eat催化合成乙酸酯的底物选择、反应特性，尤其是酶分子结构与催化合成乙酸酯的内在机制尚未明晰，阻碍了生物酶法合成乙酸酯类物质的技术应用。基于此，本研究以异常威克汉姆酵母YF1503来源的醇酰基转移酶Eat276为模板，从非酿酒酵母Hanseniaspora uvarum基因组中挖掘得到新型醇酰基转移酶EatH，首次系统表征其酶学性质，深入探讨其催化乙酸酯形成的分子机制，为拓展Eat家族资源库，以及酶的定向改造与设计提供基础数据，对于推动乙酸酯生产由化学法合成向“低碳生物合成”升级具有重要的指导作用与实际意义。
本研究以课题组前期筛选的来源于异常威克汉姆酵母YF1503的醇酰基转移酶Eat276为模板，通过基因挖掘从非酿酒酵母Hanseniaspora uvarum中鉴定出新型醇酰基转移酶EatH，经异源表达与纯化后系统表征其酶学性质，显示EatH是目前已知的具有最优异热稳定性和pH稳定性的醇酰基转移酶，其对短链醇至芳香醇的醇类底物均展现出催化能力，且对短链酰基供体具有高选择性。研究还利用AlphaFold 3、分子动力学模拟等结合性质研究、定点突变等技术进一步揭示了EatH活性位点在底物结合与催化过程中的分子机制。论文首次阐明Hanseniaspora uvarum来源EatH的催化特性、蛋白结构与关键氨基酸位点的分子机制，填补Eat家族“结构-功能”关联研究的空白，为醇酰基转移酶的理性设计与工业化应用奠定了分子基础，为乙酸酯的绿色生物合成提供重要数据与理论支撑。
乙酸酯是发酵、烘焙食品中花果香风味的主要贡献者，更因其良好溶解性、较低毒性及可降解性，成为食品加工、医药与化工领域的重要原材料之一，且全球年需求量持续增长。然而，目前依赖高能耗、高污染的化学合成来生产乙酸酯的传统方法，在现今全球碳达峰碳中和“双碳”战略倡导下，亟待低能耗、低污染、高效率的生物合成技术路径来替代。研究表明，尽管乙酸酯的生物合成可由脂肪酶/酯酶等催化醇、酸等底物来实现，但绝大多数脂肪酶/酯酶在催化乙酸酯合成过程中，需控制反应体系保持较低的水含量以防止酯化反应由合成转向水解，而添加有机溶剂等助剂则加剧了环境压力。课题组前期从产酯酵母——异常威克汉姆酵母YF1503中发掘到醇酰基转移酶Eat276，其能在水相条件下高效催化乙醇与乙酰辅酶A合成乙酸酯，因此，利用Eat在水相条件下催化乙酸酯的生物合成，是取代目前化学合成法生产乙酸酯的最可行路径之一。然而，值得注意的是，目前对于微生物来源醇酰基转移酶Eat的相关研究较为匮乏，Eat催化合成乙酸酯的底物选择、反应特性，尤其是酶分子结构与催化合成乙酸酯的内在机制尚未明晰，阻碍了生物酶法合成乙酸酯类物质的技术应用。基于此，本研究以异常威克汉姆酵母YF1503来源的醇酰基转移酶Eat276为模板，从非酿酒酵母Hanseniaspora uvarum基因组中挖掘得到新型醇酰基转移酶EatH，首次系统表征其酶学性质，深入探讨其催化乙酸酯形成的分子机制，为拓展Eat家族资源库，以及酶的定向改造与设计提供基础数据，对于推动乙酸酯生产由化学法合成向“低碳生物合成”升级具有重要的指导作用与实际意义。
本研究以课题组前期筛选的来源于异常威克汉姆酵母YF1503的醇酰基转移酶Eat276为模板，通过基因挖掘从非酿酒酵母Hanseniaspora uvarum中鉴定出新型醇酰基转移酶EatH，经异源表达与纯化后系统表征其酶学性质，显示EatH是目前已知的具有最优异热稳定性和pH稳定性的醇酰基转移酶，其对短链醇至芳香醇的醇类底物均展现出催化能力，且对短链酰基供体具有高选择性。研究还利用AlphaFold 3、分子动力学模拟等结合性质研究、定点突变等技术进一步揭示了EatH活性位点在底物结合与催化过程中的分子机制。论文首次阐明Hanseniaspora uvarum来源EatH的催化特性、蛋白结构与关键氨基酸位点的分子机制，填补Eat家族“结构-功能”关联研究的空白，为醇酰基转移酶的理性设计与工业化应用奠定了分子基础，为乙酸酯的绿色生物合成提供重要数据与理论支撑。
研究亮点
基因挖掘获得新型醇酰基转移酶EatH。
EatH在25-35°C的温度条件下孵育24小时仍可保持稳定。
初步阐明了EatH的结构与活性位点的关系，N149位点可作为醇酰基转移酶Eat底物特异性改造的有效靶点。
基因挖掘获得新型醇酰基转移酶EatH。
EatH在25-35°C的温度条件下孵育24小时仍可保持稳定。
初步阐明了EatH的结构与活性位点的关系，N149位点可作为醇酰基转移酶Eat底物特异性改造的有效靶点。
研究结果
►通过基因挖掘获得了一个新型醇酰基转移酶EatH，最适反应条件为pH 7.5和35°C，该酶具有良好的热稳定性和pH稳定性，对多种金属离子、有机溶剂和表面活性剂均具有较高的耐受性。
►EatH偏爱短链酰基供体，而具有广泛的醇类物质底物谱，对短链醇至芳香醇的醇类底物均展现出催化能力。
►利用AlphaFold 3对EatH结构预测表明，EatH具有典型的α/β折叠水解酶的特征，整体结构由一个核心催化域和一个盖子结构域组成，其催化三联体为Ser124-His296-Asp148，氧阴离子洞为Leu58和Leu125。
►分子对接、分子动力学模拟以及定点突变技术预测并验证了EatH对催化和底物结合过程至关重要的氨基酸位点。Tyr123和Phe297之间形成的Π-Π堆积的相互作用对活性中心的稳定至关重要，Tyr204的空间位阻对酶的底物特异性具有重要影响，Asn149位点和Gln154位点对于蛋白质构象灵活性具有重要作用。
►通过基因挖掘获得了一个新型醇酰基转移酶EatH，最适反应条件为pH 7.5和35°C，该酶具有良好的热稳定性和pH稳定性，对多种金属离子、有机溶剂和表面活性剂均具有较高的耐受性。
►EatH偏爱短链酰基供体，而具有广泛的醇类物质底物谱，对短链醇至芳香醇的醇类底物均展现出催化能力。
►利用AlphaFold 3对EatH结构预测表明，EatH具有典型的α/β折叠水解酶的特征，整体结构由一个核心催化域和一个盖子结构域组成，其催化三联体为Ser124-His296-Asp148，氧阴离子洞为Leu58和Leu125。
►分子对接、分子动力学模拟以及定点突变技术预测并验证了EatH对催化和底物结合过程至关重要的氨基酸位点。Tyr123和Phe297之间形成的Π-Π堆积的相互作用对活性中心的稳定至关重要，Tyr204的空间位阻对酶的底物特异性具有重要影响，Asn149位点和Gln154位点对于蛋白质构象灵活性具有重要作用。
原文链接https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c12376
