浙江大学丁甜教授：噬菌体衍生酶在提高食品安全性中的应用

　　食源性病原体如沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌构成了显着的公共卫生威胁，导致广泛的疾病和经济损失。确保食品安全的传统方法，包括抗微生物剂和防腐剂，可能导致抗微生物菌的产生，突显了替代策略的必要性。噬菌体作为传统抗生素的有前途的替代品，由于其特定的靶向细菌和较低的潜在副作用，正重新受到关注。然而，它们的实际应用受到诸如宿主范围狭窄、耐噬菌体细菌的出现和稳定性问题等挑战的限制。最近的研究已经将重点转向噬菌体衍生的酶，包括内溶素、解聚酶、穿孔素和斯潘金斯，它们参与噬菌体的溶解循环。这些酶作为潜在的食品安全途径，在靶向和溶解细菌病原体方面表现出显着效果，使其适合于控制食源性病原体和预防食源性疾病。噬菌体衍生酶在控制双歧杆菌和增强抗菌活性时与其他抗菌药物结合也显示出潜力。因此，本综述强调了在使用噬菌体衍生酶促进食品安全方面的最新进展，讨论了它们的局限性，并提出了在食品加工和储存环境中提高其有效性的策略。

　　噬菌体编码酶的机制和结构变化

　　噬菌体裂解酶

　　内溶素是噬菌体编码的酶，可在噬菌体复制的后期降解细菌细胞壁。由靶向革兰氏阳性菌的噬菌体产生的内溶素通常具有多结构域配置，包括C端的N端酶活性结构域（EAD）和C端细胞壁结合结构域（CBD）（图1）。这两个区域由一个称为链接器的可移动部分连接。EAD负责破坏肽聚糖（PG）内的特定键，CBD与PG结合，确保EAD的催化活性。来自靶向革兰氏阴性菌的噬菌体的内溶素具有相对简单的球状结构，并且通常缺乏独特的CBD。然而，一些靶向革兰氏阴性细菌的内溶素在N端有一个或两个CBD，在C端有一个EAD，表明对不同细菌结构的结构适应。具有多阳离子尾部的溶血素在其末端具有带电区域，这使它们能够穿透细菌屏障。这一特性对于破坏革兰氏阴性菌的外膜（OM）稳定性尤为重要，它也有助于到达革兰氏阳性菌的PG层。在革兰氏阳性菌中，带正电荷的区域通过与带负电荷的磷壁酸和脂磷壁酸相互作用来改善与细胞壁的结合，从而增强了溶血素的抗菌效果。与一般的模块化和球状内溶素不同，信号锚定释放（SAR）内溶素以非活性形式固定在内膜上。在典型的噬菌体感染期间，Pin穿孔素积累并形成病灶，导致膜去极化，随后SAR内溶素释放到周质中，然后它们可以在那里重新折叠和降解PG。这种调节的激活机制确保内溶素在到达适当的细胞区室之前保持无活性，从而防止宿主细菌在噬菌体复制周期中过早裂解。

　　Phage编码的解聚酶是降解细菌多糖的酶，如胶囊多糖（CPS）、胞外多糖（EPS）和脂多糖（LPS）。这些酶通过降解保护性多糖层促进噬菌体感染，使噬菌体能够注入其DNA并开始感染过程。从结构上看，解聚酶存在于噬菌体的尾尖蛋白（TSPs）中。Phage编码的解聚酶表现出强烈的抗生物毒素活性。解聚酶在生化上分为裂解酶或水解酶（图1）。裂解酶包括果酸裂解酶、透明质酸酶和藻酸裂解酵素。果酸裂解酶已被发现存在于感染假单胞菌和葡萄球菌等细菌属的噬菌体中。这些果糖裂解酶可以穿透复杂的双氧基质。噬菌体编码的透明质酸酶存在于噬菌体链球菌中，有助于降解细菌的保护层并促进感染。透明质酸酶可以降解细菌多糖胶囊的成分。海藻酸裂解酶降解铜绿假单胞菌产生的多糖。这些藻酸裂解酶可通过改善噬菌体扩散和降解粘性双寡糖基质来增强抗双寡糖活性。水解酶还包括唾液酸酶、左旋酶、木糖苷酶、右旋糖酐酶和鼠李糖苷酶。在链球菌噬菌体中发现的唾液酸酶水解聚糖中末端唾液酸的a键。这些唾液酸酶水解细菌表面的唾液酸残留，增强噬菌体的渗透力。Levanases分解存在于芽孢杆菌噬菌体中的β-2,6连接的果聚糖。木糖苷酶水解含有木聚糖样物质的细菌生物膜基质。在乳酸菌噬菌体中发现的葡聚糖酶靶向由葡萄糖分子组成的多糖，有助于在噬菌体感染期间降解葡聚糖屏障。鼠李糖苷酶裂解鼠李糖乳糖醛酸，存在于感染沙门氏菌属、志贺氏菌属和大肠杆菌的噬菌体中。这些鼠李糖苷酶在感染过程中降解LPS的O抗原。来自枯草芽孢杆菌噬菌体φ29的GP12蛋白是一种壁磷壁酸（WTA）水解酶，具有很强的水解活性，从羟基末端降解糖基化WTA，并具有磷酸二酯酶和磷酸单酯酶活性。系统发育分析还表明，解聚酶和TSP倾向于基于其宿主细菌聚集，这表明对其底物具有很强的进化适应能力。这种宿主特异性适应突出了它们的有效性和靶向根除细菌的潜力。
 

　　穿孔素和斯潘金斯

　　穿孔素在细菌细胞内膜上形成孔，以释放噬菌体内溶素，这些噬菌体内溶素会降解PG层并导致细胞裂解。穿孔素参与细胞裂解和释放新噬菌体颗粒的精确时间，称为裂解时钟。穿孔素根据其在裂解周期中的结构、功能和作用时间进行分类，包括按结构特征划分的I类和II类穿孔素，按功能特征划分的跨膜和内溶素相关穿孔素，按作用时间划分的早期和晚期穿孔素（图1）。I类穿孔素具有多个与N端和C端构型排列的跨膜α螺旋段，而II类穿孔素由两个具有N端和C端排列的跨膜α-螺旋段组成。这两类穿孔素在噬菌体中最丰富和广泛存在。在T4样和T5样噬菌体中发现的III类穿孔素有一个跨膜α-螺旋段和一个大的周质结构域。
 

　　斯潘金斯是弥合细菌内膜和外膜之间间隙的蛋白质，完成革兰氏阴性细菌的裂解循环。它们促进从宿主细胞分离新的噬菌体颗粒，功能分为两种类型：双组分斯潘金斯（i-斯潘金斯和o-斯潘金斯）和单分子斯潘宁。双组分斯潘金斯的功能机制依赖于i-斯潘金斯和o-斯潘金斯相互作用进行膜融合。单分子蛋白将这两种功能整合到一条多肽链中，具有丰富的β-折叠状结构域。虽然斯潘金斯在噬菌体溶解机制中起着关键作用，但直接支持其食品安全应用潜力的实验证据仍然有限。

　　用于生物膜控制的噬菌体衍生酶

　　最近，噬菌体衍生的酶如解聚酶和内溶素在破坏生物膜方面显示出显着潜力。解聚酶通过降解生物膜基质，增强细菌对抗生素和宿主免疫防御的敏感性（表2）。噬菌体特异性地结合宿主细胞表面的受体以启动感染。受体结合蛋白（RBPs）利用特殊的结构域降解碳水化合物配体，包括CPS、LPS和壁钛酸（WTA）解聚酶。脱聚合酶活性的存在是某些RBP特有的，有助于打破细菌屏障，并增强噬菌体感染宿主的能力。然而，许多RBP仅在宿主识别中起作用，而没有额外的脱聚合酶活性。多组噬菌体编码的解聚酶可以扩大宿主范围。最近的发展集中在工程化去聚合酶上，以增强其稳定性和特异性，这提高了它们在不同环境条件下的功效。此外，已经开发了创新的递送系统，如在脂质体中封装或附着在纳米颗粒上，以直接将解聚酶靶向生物膜，增加其局部浓度并最小化非靶向效应。这些系统已经在食品安全应用和治疗环境中进行了探索，确保在挑战性环境中更有效地治疗细菌生物膜。

　　

　　噬菌体编码的内溶素在生物膜破坏中也起着关键作用（图2）。内溶素，包括EAD和CBD，有助于破坏生物膜结构。基因工程和嵌合的内溶素体显示出增强的抗菌和抗生物膜活性。此外，内溶菌素已被与其他抗生物膜剂结合，以提高其有效性。例如，内溶素LysSA11与天然抗菌肽Nisin的组合显着增强了不锈钢食品加工表面生物膜的去除。在食品系统中，内溶剂与天然防腐剂结合可以增强食品设备和储存表面的生物膜去除作用。因此，人工合成的内溶素有望破坏和防止生物膜的形成，为对抗细菌感染提供了双重途径。

　　由于其潜在的协同效应，噬菌体源性酶与抗菌剂、精油、抗菌肽和其他化学品的组合显示出相当大的前景。噬菌体衍生酶通过多种机制增强抗菌药物的有效性（表2）。这些酶有助于生物膜基质的分解，提高抗菌素的渗透力，并增强细菌的杀伤力，特别是在与生物膜相关的感染中。内溶素在针对革兰氏阴性细菌外膜时面临重大挑战。然而，外膜渗透性化学物质如FK13和FK16可以促进内溶素的进入。先前的研究表明，将这些抗菌药物与内溶菌素结合可以增强抗菌活性。在食品系统中，这种协同作用可以通过防止生物膜相关污染来改善易腐产品的保存。
 

　　已知有机酸，包括乳酸、醋酸、苹果酸和柠檬酸，可以破坏PG和细菌膜，并抑制生物膜的形成。然而，需要注意的是，有机酸在破坏生物膜稳定方面的有效性可能因细菌种类和环境条件而有所不同。虽然有机酸和解聚酶在生物膜去除方面的直接比较有限，但它们的组合可能具有协同作用。有机酸可能增加噬菌体衍生的去聚合酶对生物膜保护的病原体的可及性，改善生物膜去除和细菌控制。在食品系统中，可以加入有机酸来增加噬菌体衍生的去聚合酶对生物膜保护的病原体的可及性，增强生物膜去除和细菌控制。有机酸和解聚酶协同作用，增强生物膜的去除，并增加细菌膜的通透性。
 

　　抗菌肽（AMPs）通过形成孔隙、导致膜去极化和干扰细菌信号通路来破坏细菌细胞膜。虽然目前还没有关于结合解聚酶和抗菌肽（AMPs）用于生物膜抑制的直接研究，但目前的研究表明，这种方法具有显着的前景。当解聚酶分解保护性生物膜时，抗菌肽（AMPs）可以更有效地渗透并增强其抗菌活性。同时使用解聚酶和AMPs可以利用每种试剂的不同特性。解聚酶分解生物膜，损害其结构完整性，使细菌细胞更容易接触抗菌肽（AMPs）。因此，AMP可以更有效地渗透生物膜基质并根除生物膜细胞。这种双重作用策略大大提高了整体抗菌效果，并将细菌耐药的风险降到最低。
 

　　工程噬菌体内溶菌素作为抗菌剂具有显着潜力，可控制耐药病原体和生物膜（表2）。嵌合内溶素是一种工程化酶，它结合了不同内溶素的域，以增强其溶解活性并拓宽宿主范围。融合EADs和CBDs的嵌合内溶素可以被设计成靶向特定的细菌病原体，潜在地提供一种强大的工具来对抗革兰氏阳性菌。先进的技术，包括域交换、域交换和VersaTile等高通量DNA组装方法，已被用于开发含有EAD和CBD优化组合的嵌合内溶剂。这些方法显着提高了内溶菌素的抗菌活性和溶解度，从而增强了它们对耐药革兰氏阳性细菌的有效性。内溶素与外膜通透剂的融合显着提高了它们对革兰氏阴性菌的疗效，革兰氏阴性菌通常由于其外膜而更具耐药性。
 

　　CRISPR-Cas9基因组编辑技术的应用是目前正在研究的一种前沿方法，旨在增强内溶素的特异性和活性。这项技术可实现精确的改性，以开发高效针对特定细菌株的高度定制的抗菌剂。此外，将内溶菌素与抗生素结合显示出协同效应，显着增强了对生物膜的整体抗菌活性。穿孔素和斯潘金斯在对抗生物膜方面显示出显着的潜力，但它们作为消灭生物膜剂的实际用途仍在探索中。
 

　　此外，内溶蛋白是通过将内溶蛋白与噬菌体RBPs结合而产生的，这增强了它们的抗菌活性并扩大了它们的目标范围。这种方法涉及将内溶菌素与噬菌体RBPs融合，以克服革兰氏阴性细菌的外膜屏障。通过与特定的细菌受体结合，这些工程化的裂解素表现出更高的活性和特异性，使它们能够有效地降解PG层。此外，将这一概念应用于针对其他病原体已经产生了有希望的结果，这表明发现更多的噬菌体RBP可以进一步提高Innolysins作为抗菌剂的效率和范围。
 

　　工程化穿孔素是另一种重要的噬菌体衍生酶，是一个很有前途的领域。溶藻弧菌噬菌体HH109的谷蛋白-内溶素系统表明，谷蛋白和内溶素基因在大肠杆菌和溶藻弧杆菌中的过度表达会导致显着的细菌细胞死亡和结构损伤。holA和溶菌素基因的共表达表现出协同杀菌活性。对阿维菌噬菌体phiSASD1的谷蛋白-内溶素系统的研究也显示出显着的抗菌活性。大肠杆菌中holSD和lytSD基因的过度表达导致细菌细胞死亡和结构损伤。在食品系统中，穿孔素可以作为生物控制战略的一个组成部分应用，以防止食品中细菌病原体的生长，特别是那些在储存或运输过程中容易受到污染的产品。虽然工程内溶蛋白和穿孔素已经被广泛研究，但关于其他噬菌体蛋白的研究仍然存在显着差距。虽然对工程化解聚酶和蛋白酶的研究有限，但内溶素和穿孔素的成功工程表明类似的方法可能对这些蛋白质也有效。在食品系统中设计的解聚酶和蛋白酶可以改善食品加工表面生物膜的去除，提高食品安全协议的整体有效性。这些组合可以与抗生素协同作用，治疗细菌感染。这一策略不仅增强了传统抗生素治疗的疗效，还提供了一种有前途的替代方案，以帮助预防抗生素耐药细菌的出现。
 

　　内溶素因其特异性靶向和裂解细菌病原体的能力而被广泛研究，因为它们具有改善食品安全的潜力。这些酶在控制食源性病原体和预防食源性疾病方面显示出巨大的潜力。虽然其他噬菌体衍生的酶如解聚酶、穿孔素和斯潘金斯在食品应用中的探索较少，但它们也为创新和有效的食品安全解决方案提供了希望。本节回顾了这些蛋白质在食品工业中的实际应用，讨论了它们的局限性，并提出了增强其有效性的潜在方法。
 

　　噬菌体从噬菌体内提取的酵素为在整个食品供应链的多个环节提高食品安全提供了一种有价值的方法。这些酶可以在收获前干预中应用于牲畜和家禽，以显着降低细菌负荷。这减少了动物中沙门氏菌和大肠杆菌等病原体的流行，并降低了食品污染的风险。特别是内溶菌素，已被证明在降解肽聚糖和针对革兰氏阴性病原体方面有效。鉴于抗生素耐药菌株的日益普遍，这种能力尤为重要。实验应用强调了内裂解酶在降低家禽细菌负荷方面的有效性。此外，解聚酶在分解构成细菌生物膜的EPSs方面显示出希望。通过破坏这些生物膜，解聚酶可以有效减少牲畜和家禽的细菌定植和感染率，从而改善动物健康，并降低食品供应链中的污染风险。
 

　　在收获后的干预措施中，噬菌体衍生酶仍然是通过表面去污和食品保存确保食品安全的关键。内溶菌素和解聚酶可用于食品加工环境中的表面消毒，以高特异性针对和溶解细菌细胞。这种特殊性使得它们在保持清洁表面和最小化交叉污染风险方面得到了很好的研究。虽然穿孔素和斯潘金斯主要在细菌溶解的背景下被研究，但它们也显示出在食品安全应用方面的巨大潜力。虽然它们在食品加工中的直接使用仍处于早期阶段，但其特性表明它们在改进表面去污和保存技术方面具有很大的潜力。通过帮助将溶解酶（如内溶素）输送到细菌细胞，穿孔素可以有效地用于食品加工环境中，以针对和消除细菌污染物。
 

　　然而，一些限制因素限制了噬菌体衍生酶在食品工业中的广泛应用。这些酶在各种工艺条件下的稳定性，包括高温、pH值波动和暴露于食品添加剂，仍然是一个主要问题。许多酶的活性低于其最佳条件，这会限制它们在复杂食物基质中的有效性。此外，与重组酶合成和纯化相关的高生产成本为大规模应用带来了经济障碍。监管挑战也构成重大障碍，因为食品级酶应用的审批过程需要广泛的安全和功效评估。在食品中应用重组噬菌体衍生酶时，安全性考虑尤为重要。虽然这些酶专门针对细菌病原体，但它们的潜在免疫原性、过敏性以及与食品成分的相互作用需要彻底评估。

　　确保食品加工环境的卫生对于保持食品安全和质量至关重要。噬菌体衍生的酶，包括穿孔素、斯潘金斯、内溶素和解聚酶，为此提供了有希望的解决方案。这些酶是天然杀菌剂，在针对细菌病原体方面表现出高度特异性，是食品加工环境中表面去污的理想选择。通过分解生物膜基质并确保完全细菌溶解，使食品加工设施中的污染风险降低，诸如穿孔素、斯潘金斯具有独特的优势。在表面去污中使用这些酶已被证明在预防和消除各种食品加工环境中的细菌污染方面非常有效，特别是在生物膜普遍存在的地方。除了表面去污之外，噬菌体衍生酶在食品包装应用中也有很大的前景。这些酶可以被加入到包装材料中，以抑制细菌生长，延长易腐产品的保质期。然而，由于温度和湿度波动等环境因素，这些酶在包装材料中的稳定性是一个关键挑战，这些因素会随着时间的推移而降低其活性。封装策略已成为提高噬菌体衍生酶在包装应用中的稳定性和有效性的可行解决方案。微胶囊化、脂质体胶囊化和喷雾干燥等技术已被探索，以保护酶免受环境胁迫并延长其功能寿命。

　　Conclusion

　　研究结果突显了抗生素相互作用的复杂性，特别是在联合应用时，表明这些做法如何无意中促进了新耐药性的发展。这强调了在临床和农业应用中小心谨慎使用抗生素的重要性。此外，还强调了噬菌体衍生酶（包括内溶素、解聚酶、穿孔素和斯潘金斯）作为传统抗生素替代品的潜力。这些酶提供了独特的作用机制，使它们能够有效地针对和溶解细菌细胞，包括那些通常对常规治疗有抗药性的生物膜内的细菌细胞。它们能够特异而有效地针对致病菌，同时减少对有益微生物的伤害，在抗击抗菌素耐药性方面提供了相当大的优势。未来的研究应集中在通过先进的工程技术优化这些酶，并探索它们在保存食品质量和确保食品安全方面的潜在应用。最终，虽然抗生素的组合可能无意中导致耐药性的发展，但噬菌体衍生酶代表了一种有前途且创新的替代方案，需要更深入的研究。