M13噬菌体双展示系统能够同时呈现靶向元件和信号报告元件，在生物传感领域具有巨大潜力。然而，不同展示位点组合的效率和性能特征尚不明确。本研究系统评估了M13噬菌体的双展示能力，将副溶血性弧菌特异性纳米抗体展示在pIII蛋白上，同时将高灵敏度纳米荧光素酶分别展示在pVI、pVII、pVIII或pIX衣壳蛋白上，并比较单价展示和多价展示两种策略的优劣。结果发现，展示效率因衣壳蛋白位点和辅助噬菌体感染时间而异；基于pVIII的单价展示获得了最高的比发光活性和功能共展示比例。优化后的mpVIII探针在检测副溶血性弧菌时表现出高特异性、高灵敏度（检出限为102 cfu/mL）及优异的抗干扰能力，并成功用于虾样品中的目标菌检测。该工作为构建高性能双展示噬菌体探针提供了参考依据和实用框架，将助推一步式生物传感技术的发展。
研究亮点
- 系统比较了M13噬菌体四种不同衣壳蛋白位点在单展示和多展示策略下的双功能蛋白共展示效率，明确了位点选择与感染时机对展示效果的关键影响。
- 发现pVIII位点单展示策略具有最高的比发光活性和功能共展示比例，而多展示策略因衣壳蛋白空间拥挤和组装构象限制，其效率反而低于单展示。
- IPTG诱导可显著提高部分位点的功能共展示比例，但不同位点的响应机制存在差异。
- 优化后的mpVIII探针实现对副溶血性弧菌的一步式检测，检出限达102 cfu/mL，特异性强、抗干扰能力好，且未结合噬菌体可回收再利用，能够有效降低检测成本。
研究介绍
- 传统M13展示系统主要聚焦于单一蛋白的展示。随着诊断和靶向治疗需求的日益复杂，能够同时呈现靶向元件和信号报告元件的双展示噬菌体，有望实现“一步式”检测。目前双展示策略主要依赖“pIII单展示结合pVIII单/多展示”模式，但存在需要额外体外修饰步骤、信号蛋白纯化繁琐等问题，且两个大分子功能蛋白在同一噬菌体颗粒上的高效可控共展示仍是生物工程领域的重大挑战。
- 针对上述问题，本研究以副溶血性弧菌特异性纳米抗体Nb20为靶向分子、高灵敏度NanoLuc荧光素酶为报告蛋白，系统构建了一系列重组噬菌体。首先，利用噬菌粒pComb3X与辅助噬菌体M13KO7构建了四种单价双展示噬菌体（mpVI、mpVII、mpVIII、mpIX）。研究发现，展示效率显著依赖于衣壳蛋白位点和辅助噬菌体感染时宿主菌的生长阶段。其中，mpVIII在所有感染时间点均表现出最高的比发光活性（CSU），双展示噬菌体（NDP）比例最高达2.20%。相比之下，mpVI虽可获得较高的噬菌体滴度（>1011 pfu/mL），但双展示噬菌体比例较低（0.05%-0.44%）。Western blot和相关性分析表明，噬菌体滴度、CSU与宿主细胞内Nluc mRNA绝对表达量呈正相关，表明提高外源基因转录水平有助于增强展示效率。
- 接着，研究将Nluc基因克隆至辅助噬菌体M13KO7基因组中，构建多价双展示系统（ppVI、ppVII、ppIX）。然而，所有多展示系统的CSU和NDP均显著低于对应的单展示系统。研究推测，多价融合导致Nluc在噬菌体组装时因空间拥挤和构象受限而活性大幅下降，同时衣壳蛋白的突变或融合可能促使病毒颗粒组装成非标准构型，甚至导致部分重组辅助噬菌体无法存活。为提升展示效率，研究采用IPTG诱导Nb20-gIII融合基因的过表达。结果显示，诱导后mpVII和mpVIII的CSU和NDP显著提高，mpVI、mpVII、mpVIII的CoDP比例分别提升至诱导前的2.45、2.31和1.90倍。但不同位点的响应差异显著，且诱导伴随细胞毒性增加，说明双展示噬菌体的组装受多种复杂机制调控。
- 基于上述系统比较，研究选择性能最优的mpVIII探针进行实际检测应用。结果表明，mpVIII特异性好、抗干扰性能强。在加标虾样品检测中，检测信号与副溶血性弧菌浓度对数呈良好线性关系，检出限达102 cfu/mL。此外，检测后未结合的mpVIII可从滤液和洗涤液中有效回收，回收的噬菌体在低浓度靶标（102–104 cfu/mL）检测中仍能获得与原始mpVIII相当的信号，表明该探针具有良好的可重用性，有助于降低检测成本。
